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研究背景
盡管在手術、放療和分子靶向治療方面取得了進展，非小細胞肺癌的死亡率仍然很高。針對程序性細胞死亡蛋白配體1(PDL1)程序性細胞死亡蛋白1(PD1)軸的ICIs通過激活細胞毒性T細胞活性來促進腫瘤細胞的殺傷。雖然這些抑制劑已經被批準用于晚期NSCLC的治療，但由于腫瘤微環境(TME)中存在多種免疫抑制屏障，大多數患者幾乎沒有臨床獲益。因此，迫切需要努力尋找能夠克服這些屏障，提高ICIs療效的免疫調節劑。RT具有潛在的免疫調節特性，因為它可以觸發免疫原性細胞死亡和激活抗原提呈細胞，使腫瘤特異性T細胞交叉激活，不僅可以限制原發腫瘤的生長，還可以產生針對遠處(非內窺鏡)轉移灶的全身性效應。不幸的是，最佳的RT劑量和潛在的分子機制取決于癌癥的類型，對于非小細胞肺癌，包括誘導最佳免疫調節的測序和劑量/分割方案，目前還知之甚少。新出現的證據支持ICIs和RT聯合治療包括NSCLC在內的各種腫瘤類型的可能性。一項I期試驗顯示，以前接受過放射治療的NSCLC患者在接受ICIs治療的情況下比沒有接受過RT治療的患者有更長的無進展生存期。然而，由于之前的試驗缺乏確定的分子機制，目前的臨床試驗測試這種組合是由經驗選擇指導的，而這些選擇可能并不是最優的。在這里，我們提供了機械性的見解，可能會加速非小細胞肺癌RT和ICIs聯合治療的發展。
技術路線
研究結果
特定劑量的RT可增強PD1阻滯劑的療效
在正在進行的人類和鼠腫瘤的研究中，已經報道了不同劑量的低分割RT，并提出了劑量和分割的關鍵重要性。因此，我們首先優化了微計算機斷層掃描(μCT)引導下的HKP1荷瘤肺RT方案，該方案可以提高PD1抑制的治療效果。我們測試了一種先前報道在乳腺癌模型中具有免疫調節活性的RT方案：8Gy連續3天(8Gy×3)，以及兩種較低劑量的方案，4Gy×3和0.5Gy×3(圖1a)。值得注意的是，4Gy×3(4GyRT)聯合PD1抗體可顯著控制腫瘤(圖1b，c)并提高存活率(圖1d)。此外，40的小鼠無瘤存活，而僅接受PD1抗體治療的隊列小鼠的無瘤存活率為10。與單獨抑制PD1相比，0.5Gy×3和8Gy×3的其他劑量聯合PD1抑制并不能顯著控制腫瘤或提高生存率(圖1e，f)。
通過聯合治療獲得持久的T細胞活性
為了闡明不同放療劑量的不同影響，我們在最后一次放療后1d(放療開始后第4天)檢測了T細胞浸潤和細胞因子的產生。在所有被檢查的隊列中，4GyRT顯示在腫瘤胰島浸潤的CD8T細胞數量最多(圖2a和擴展數據圖1a)，在HKP1肺中干擾素γ/腫瘤壞死因子α/CD4T細胞和GzmB/CD8T細胞數量最多(圖2b，c和擴展數據圖1b)。這些4GyRT誘導的T細胞活性與其抑制PD1的協同作用是一致的。越來越多的T細胞被招募到HKP1肺部，逐漸獲得功能障礙的表型，表現為CD4T細胞的效應細胞因子表達減少，如干擾素γ和腫瘤壞死因子α(擴展數據圖2a，b)。為了確定4GyRT是否增強了原有T細胞的功能，我們用S1P受體抑制劑FTY720治療HKP1小鼠，FTY720可以阻止活化的T細胞從淋巴結流出(擴展數據圖2c)。正如預期的那樣，FTY720治療通過減少循環T細胞(擴展數據圖2d)，將4GyRT的效果局限于肺部原有的T細胞。與對照組相比，FTY720取消了4GyRT增加干擾素γ/腫瘤壞死因子α/CD4T細胞和GzmB/CD8T細胞的能力(擴展數據圖2e)。因此，在FTY720處理的小鼠中，4GyRT和抗PD1聯合治療的效果被取消(擴展數據圖2f)。這些發現表明，4GyRT并不能重新激活TME中原有的功能紊亂的T細胞。
4GyRT治療可激活TME中的肺駐留棒狀細胞
為了探索4GyRT誘導抗腫瘤免疫反應的機制，我們檢測了RT誘導的樹突狀細胞(DC)的激活。4GyRT治療既沒有引起腫瘤細胞死亡(擴展數據圖4a)，也沒有增加支氣管淋巴結中CD103交叉呈遞的DC(擴展數據圖4b)。接下來，我們對接受RT(0Gy、4Gy或8Gy×3)聯合IgG或PD1抗體治療的HKP1肺進行RNASEQ分析。比較4GyRT組、0Gy(模擬)組和8GyRT(無效劑量)組在抗PD1治療前后的差異表達基因(P<0.01，倍增≥2和最小二乘平均≥5)。通過將IgG隊列中4GyRT上調的基因與抗PD1隊列重疊，我們識別了144個特定于該有效輻射劑量上調的基因(圖3a和擴展數據圖5a)。為了確定這4個GyRT特征基因的細胞來源，我們對接受0Gy或4GyRT的HKP1荷瘤肺進行了單細胞RNAseq(scRNAseq)分析。通過將144個簽名基因投影到t分布隨機鄰居嵌入(tSNE)圖，我們發現這些基因在4GyRT后在氣道上皮/棒狀細胞簇中顯著上調(圖3b)。
棒狀細胞分泌體與聯合治療的療效有關
無論采用哪種耗竭方法，攜帶HKP1的肺對4GyRT的免疫反應均明顯減弱，表現為T細胞向腫瘤胰島的浸潤顯著減弱，效應細胞因子的產生減少(CD4T細胞中的干擾素γ/腫瘤壞死因子α和CD8T細胞中的GzmB)(圖4C和擴展數據圖6d)。值得注意的是，在HKP1荷瘤小鼠中，棒狀細胞缺陷取消了聯合治療的療效(圖4d)。
電子顯微鏡對棒狀細胞的進一步表征顯示，與對照組相比，從4GyRT治療的肺中分離出的棒狀細胞中分泌囊泡的數量增加(擴展數據圖8a，b)。我們推測放療后棒狀細胞的分泌可能在提高ICIs療效中起作用。為了解決這個問題，我們使用Scgb1a1CreERTM/Snap23Flox/Flox轉基因小鼠(簡稱Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)阻止棒狀細胞分泌蛋白進入肺TME。突觸體相關蛋白23(SNAP23)是SNARE復合體的關鍵成分，它介導細胞內囊泡融合到膜上，調節胞吐。他莫昔芬治療Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠允許有條件的棒狀細胞特異性缺失Snap23基因(圖5a)，而不改變細支氣管的完整性(擴展數據圖8c)。對支氣管肺泡灌洗液(BALF)的分析證實，與野生型對照相比，4GyRT治療的Scgb1a1cre/Snap23fl/fl小鼠的棒狀細胞分泌組成分CC10顯著減少(圖5b)。與棒狀細胞消融一致，SNAP23缺乏抑制了HKP1肺對4GyRT反應中T細胞的浸潤和激活(圖5c和擴展數據圖8d)。
棒狀細胞減少促腫瘤炎癥
球狀細胞缺陷(DT治療)小鼠的肺顯示髓系/淋巴細胞比率增加(Mye/LYM，對照組和DT治療小鼠分別為0.96和1.34，圖6a)。此外，桿狀細胞缺陷肺中的髓樣細胞表現出炎癥介質的表達增加，如IL1b、PTGS2和TNF(圖6b)，據報道它們可以抑制適應性抗腫瘤免疫。我們推測這些棒狀細胞介導的TME改變可能影響了T細胞效應器的表型。使用基于圖形的分類，T細胞被分成9個簇(圖6c)，每個簇的功能狀態根據它們的特征基因來確定(圖6c和補充表2)。我們觀察到效應T細胞簇(C5)顯示細胞因子、效應分子(干擾素γ和腫瘤壞死因子)和T細胞活化標志物(PDCD1和)表達增加，增殖T細胞簇(C9)顯示顆粒酶和Ki67表達，調節性T細胞簇(C8)顯示Foxp3和IL2ra表達(圖6c)。值得注意的是，與對照組(分別為2.63和1.96)相比，去桿狀細胞(DT治療)降低了效應器、增殖T細胞和Treg細胞的比率((C5C9)/C8)。總之，這些scRNAseq結果表明，RT激活的棒狀細胞的存在有助于適應性抗腫瘤免疫，可能是通過限制HKP1腫瘤中髓系細胞介導的炎癥。BALF樣本的ELISA檢測顯示，與0Gy對照組相比，4GyRT顯著降低了HKP1TME中IL1β、PGE_2和TNFα的水平(圖6d)，但在沒有棒狀細胞(DT處理的Scgb1a1cre/iDTR)或其分泌體(Scgb1a1cre/Snap23fl/fl)的情況下，4GyRT未能減少這些炎癥因子(圖6d)。為了證明RT誘導的棒狀細胞分泌體的臨床相關性，我們在II期新輔助臨床試驗(NCT02904954)54中評估了接受RT聯合ICIs(抗PDL1)治療的NSCLC患者的血漿水平。分別于首次立體定向全身放射治療(SBRT)前1d和末次SBRT后1d采集血漿。匹配患者的CC10血漿濃度比較(放療前和放療后)顯示，大多數獲得病理改善的患者在放療后血漿CC10水平升高(8人中有5人)，而無反應的患者(9人中有0人，P0.0301)(圖6e)，表明棒狀細胞激活與聯合治療的病理反應有關。綜上所述，這些發現表明，RT激活的棒狀細胞通過其分泌體抑制了HKP1肺中的腫瘤前炎癥，從而增強了適應性抗腫瘤免疫。
棒狀細胞因子改善PD1受體阻滯劑的療效
這些體外研究結果促使我們研究棒狀雞尾酒是否能反映4GyRT在改善體內PD1阻斷方面的效果。我們每天給HKP1小鼠鼻內注射棒狀雞尾酒(每只小鼠每只蛋白20ng)，連續3d(第1113天)，并聯合PD1抗體(圖8a)。值得注意的是，與模擬對照相比，聯合PD1抗體的棒狀雞尾酒治療可顯著控制腫瘤并提高HKP1小鼠的存活率(圖8b，c)。與4GyRT相似，支氣管肺泡灌洗液分析顯示，與對照組相比，棒狀雞尾酒治療組小鼠的腫瘤壞死因子α、前列腺素E_2和IL1β水平較低(圖8d)。最后，為了確定棒狀雞尾酒和PD1抗體聯合治療是否能產生持久的抗腫瘤免疫，我們進行了腫瘤再攻擊實驗。事實上，與對照組相比，存活的小鼠在35天內清除了肺部的腫瘤細胞(擴展數據圖10e)。總之，這些發現表明，棒狀細胞分泌蛋白通過抑制免疫抑制的MDSCs和增強T細胞功能來提高PD1阻斷的療效。
研究小結
在NSCLC模型中，確定了一種特定劑量的RT，當與ICIs聯合使用時，該劑量可使腫瘤消退并提高存活率。
RT的免疫調節作用歸因于激活的肺居留Scgb1a1棒狀細胞。值得注意的是，具有棒狀細胞特異性突觸體相關蛋白23基因敲除的小鼠未能從聯合治療中受益，這表明棒狀細胞分泌體起著關鍵作用。
我們鑒定了八種棒狀細胞分泌蛋白，它們可以抑制免疫抑制的髓樣細胞，減少腫瘤前炎癥，增強抗腫瘤免疫。值得注意的是，聯合治療后NSCLC患者血漿中棒狀細胞分泌組成員CC10水平升高。
我們的觀察結果與主流觀點一致，即RT聯合ICIs可引起抗腫瘤反應。值得注意的是，我們的研究提供了一種機制，通過輻射誘導駐肺的Scgb1a1棒狀細胞分泌增強ICIs對非小細胞肺癌的治療效果。越來越多的證據表明，與促癌炎癥相關的免疫抑制微環境構成了癌癥免疫治療成功的主要障礙，并提出了以炎癥為靶點來提高ICIs療效的建議。與已報道的棒狀細胞在過敏、哮喘和COPD中的抗炎作用一致，我們展示了RT激活的棒狀細胞分泌蛋白在非小細胞肺癌中的耐人尋味的作用，它可以對抗多種免疫抑制介質，增強適應性抗腫瘤免疫。從我們的研究中得到的見解在臨床翻譯中具有顯著的潛力。目前，由于特定物種的輻射敏感性和靶區體積的差異，目前缺乏將放射劑量從動物模型轉換到人類以及反之亦然的標準。然而，我們的研究表明，未來的人類非小細胞肺癌臨床試驗應該考慮優化一種能有效介導肺部常駐棒狀細胞激活的放射治療劑量。目前，缺乏在不損害肺上皮完整性的情況下激活棒狀細胞的藥理學或遺傳學方法。證明給予棒狀細胞雞尾酒增強了ICIs的療效，在開發這些因素作為非小細胞肺癌的治療方式方面具有巨大的潛力。進一步的研究需要確定能夠產生強有力的治療效果的分泌因子的最佳組成。值得注意的是，SBRT提高了對新輔助SBRTICIs治療有反應的NSCLC患者的CC10水平，這一發現表明，RT誘導的血漿中的棒狀細胞分泌因子可能有可能作為對SBRT/ICIs治療有反應/無反應的非侵入性生物標志物。總之，來自我們研究的見解有可能為未來的臨床試驗提供指導，使放射和免疫治療組合的有效性最大化，以提高病理應答率和改善非小細胞肺癌患者的存活率。
